Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung der Summe der Aminosäuren in Apfelpresskuchen
Wir haben die Möglichkeit der Verwendung der Ninhydrin-Reaktion für die quantitative Analyse der Summe freier α-Aminosäuren in Apfelpresskuchen untersucht. Darüber hinaus haben wir die Optimierung und Bewertung des quantitativen Gehalts der α-Aminosäuren im Ausgangsmaterial nach Säurehydrolyse durchgeführt.
Probenvorbereitung
- 10,0 g luftgetrocknetes Ausgangsmaterial werden sechsmal mit heißem Wasser (80-90 °C, Flüssig-Feststoff-Verhältnis 1:8) für je 1 Stunde extrahiert. Die Extrakte werden filtriert, vereinigt und in einem 500-ml-Messkolben mit Wasser auf die Marke aufgefüllt (Ausgangsextrakt oder Probe 1).
- Um den Einfluss von Ballaststoffen auf den quantitativen Gehalt der Summe der α-Aminosäuren in Apfelpresskuchen zu untersuchen, wurde ein wässriger Extrakt, der von Ballaststoffen befreit ist (Probe 2), hergestellt.
Optimierung der Ninhydrin-Reaktion
- Die Reaktionsprodukte beider Proben mit 0,2 % wässriger Ninhydrin-Lösung zeichnen sich durch hohe zeitliche Stabilität aus: Innerhalb von 1-1,5 Stunden nach Reaktionsbeginn sinkt ihre Absorption bei 400 nm um 0,2-0,5 %.
- Von allen untersuchten α-Aminosäuren ist das Reaktionsprodukt von Prolin mit Ninhydrin bei 400 nm am stabilsten (Absorptionsabnahme von 0,2 % innerhalb von 1-1,5 Stunden).
- Basierend darauf wurden die Grenzkonzentrationen von Prolin in der Ninhydrin-Reaktion ermittelt, die dem Lambert-Beerschen Gesetz folgen (0,016-0,072 mg/ml).
Quantitative Bestimmung der Aminosäuren
- Zu 1,5 ml der zu untersuchenden Extrakte (Proben 1 und 2) werden 1,7 ml 0,2 % wässrige Ninhydrin-Lösung gegeben und 20 Minuten bei 120 °C erhitzt. Nach Abkühlung werden je 2 ml der Reaktionsprodukte mit Wasser verdünnt (auf 10 ml für Probe 1 und 5 ml für Probe 2) und die Absorption nach 1 Stunde bei 400 nm gemessen.
- Parallel dazu wird die Reaktion von 1,5 ml einer frisch hergestellten 0,017 % Prolin-Standardlösung mit 1,7 ml 0,2 % wässriger Ninhydrin-Lösung durchgeführt, das 2 ml-Reaktionsprodukt mit Wasser auf 5 ml verdünnt und die Absorption unter den gleichen Bedingungen gemessen.
- Der Gehalt an Gesamtaminosäuren in den Proben relativ zu Prolin wird nach folgender Formel berechnet:
X = (Dx * mo * 100 * a * 100%) / (Do * mx * (100 – W) * b)
Säurehydrolyse zur Bestimmung der Gesamtaminosäuren
- Für den Säureaufschluss wurde eine 0,9 M Salzsäurelösung verwendet, die einen nahezu vollständigen Abbau der Proteine und Peptide im wässrigen Extrakt zu α-Aminosäuren ermöglicht.
- Der Einfluss der Salzsäurekonzentration (0,45 M – 5,5 M) auf die Ausbeute an Gesamtaminosäuren wurde untersucht. Die höchste Ausbeute von 0,85 % (bezogen auf Prolin) wurde mit 0,9 M Salzsäure erzielt.
- Die Dauer des Säureaufschlusses (1 h – 12 h) wurde ebenfalls optimiert. Die maximale Ausbeute von 1,71 % (bezogen auf Prolin) wurde nach 10-stündiger Hydrolyse erreicht.
Entfernung von Ballaststoffen
- Der Säurehydrolyseextrakt (Probe 3) und ein davon gereinigter Extrakt (Probe 4, Entfernung von Ballaststoffen durch Ethanolfällung) wurden mittels Ninhydrin-Reaktion untersucht.
- Der Gehalt an Gesamtaminosäuren in Probe 3 betrug 1,549 %, in Probe 4 hingegen nur 1,114 % (jeweils bezogen auf Prolin).
Somit konnte gezeigt werden, dass Ballaststoffe den quantitativen Aminosäuregehalt im Apfelpresskuchen beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Welche Methoden gibt es zur quantitativen Bestimmung von Protein in Lebensmitteln?
Eine gängige Methode ist die Ninhydrin-Reaktion, bei der die Summe der freien α-Aminosäuren quantifiziert wird. Darüber hinaus kann eine Säurehydrolyse eingesetzt werden, um die Gesamtheit der Aminosäuren, auch die in Proteinen gebundenen, zu erfassen.
Wie lässt sich der Einfluss von Ballaststoffen auf den Proteingehalt minimieren?
Durch eine Ethanolfällung können Ballaststoffe und andere Begleitstoffe aus dem Extrakt entfernt werden, bevor die quantitative Analyse durchgeführt wird. Dies führt zu genaueren Ergebnissen für den tatsächlichen Proteingehalt.
Welche Faktoren beeinflussen die Ausbeute an Aminosäuren bei der Säurehydrolyse?
Die Konzentration der Salzsäure sowie die Dauer des Säureaufschlusses haben einen signifikanten Einfluss auf die Ausbeute an freigesetzten Aminosäuren. Optimal sind eine 0,9 M Salzsäurelösung und eine Hydrolysedauer von 10 Stunden.
Wie kann die Stabilität der Ninhydrin-Reaktionsprodukte sichergestellt werden?
Die Reaktionsprodukte von Prolin mit Ninhydrin zeichnen sich durch besonders hohe Stabilität aus. Daher wird Prolin als interner Standard für die quantitative Bestimmung verwendet, da die Absorption des Prolin-Ninhydrin-Komplexes über 1-1,5 Stunden nach Reaktionsbeginn nur um 0,2 % abnimmt.